东汉末年，中原陷入了军阀的割据混战之中，最后形成了魏、蜀、吴三国鼎立的局面。敦煌地区在曹魏的统治之下，生产有了进一步的发展。西晋虽经历了短期的统一，但八王之乱、永嘉之乱很快就将西晋推入了灭亡，之后晋室南迁，北方少数民族入主中原，大批中原人士西迁。十六国时期（304—439），敦煌先后归属于前凉、前秦、后凉、西凉、北凉五个政权。

　　　　曹魏在统一北方之初，无暇顾及河西，到魏文帝曹丕时，在河西继续西汉以来的屯戍政策，并任命尹奉为敦煌太守。魏明帝太和元年（227年），仓慈继任敦煌太守。当时，由于东汉以来形成的豪强大族的势力日益强大，兼并土地之风盛行，豪强们还压榨农民，敲诈勒索西域商贾。针对这种情况，当时的凉州刺史徐邈和敦煌太守仓慈抑制豪强，解除豪强的私人武装，限制豪强兼并土地，打击了豪强大族的器张气焰。仓慈还抚恤贫下，鼓励异族通婚，并为商人提供贸易和交通上的便利条件，这些措施使得敦煌地区社会安定，生产和商业都有了较大的发展。仓慈之后，王迁、赵基相继出任敦煌太守。齐王嘉平元年（249年），皇甫隆出任敦煌太守，改变了敦煌妇女在穿衣方面的落后习俗，大力推广中原的先进生产工具和耕作技术，敦煌的农业得到进一步发展。

　　　　前凉张氏的统治中心虽在武威，但敦煌仍是当时的西域重镇。张轨大量依靠敦煌人士如宋配、阴充、阴澹、氾瑗等人为其运筹，由于这些人的辅佐，河西生产有了较大发展，人口有所增加，使张轨能“威著西州，化行河右”。张骏太元二十二年（345），敦煌、晋昌、高昌三郡和西域都护、戊己校尉、玉门大护军三营合并成为沙州，治所敦煌，以西胡校尉杨宣为刺史。杨宣任内，曾组织民众兴修水利，建五石斗门，堰水溉田，建成十五里的“阳开渠”；他还曾用自家的万斛粮食买石头修理城北北府渠上的平河斗门。此外，沙州太守阴澹也曾于任内在城西南修七里长渠，可将州城西南的水引自西北的水渠，灌溉城西的大片土地，使这一地区的百姓受益不少，安居乐业，故此渠被称为“阴安渠”。

　　　　前秦于苻坚建元十二年（376），灭前凉，将包括敦煌在内的河西地区归入治下。十八年（382），派吕光攻龟兹。建元二十一年（385），为巩固经营西域的基地，苻坚迁江汉百姓一万户、中原百姓七千余户到敦煌。大批中原士族和百姓的到来，又一次促进了敦煌地区的开发。此后不久，前秦便因淝水之战的失利而瓦解。386年，吕光从西域返回河西，在凉州建立了后凉政权（386—403）。麟嘉七年（395），后凉内乱，西奔敦煌、晋昌的武威、张掖以东之人有数千户之多，敦煌又一次输入了大量的人力。此外，后凉的敦煌太守孟敏曾在州城西南主持修建了长二十里的水渠，引甘泉水灌溉农田，人称“孟授渠”，促进了当地农业的发展。400年，李暠在敦煌自称冠军大将军、沙州刺史，建立了独立于后凉政权的割据政权——西凉。敦煌在历史上第一次成为一个独立政权的都城。西凉政权统治时期，建立了县、乡、里三级行政管理机构，实行严密的编户制度，并鼓励生产，敦煌地区出现了五谷丰收，百姓乐业的景象。李暠在敦煌城内为其父立先王庙；修建恭德殿、靖恭堂、嘉纳堂、谦德堂，主持朝政、参阅武事；并设泮宫，增高门学生五百人。于阗、鄯善等西域王国也来此朝贡，敦煌俨然有都城之派。但沮渠蒙逊建立的北凉政权（401—439）对西凉构成很大威胁，使得李暠不得不于建初元年（405）迁都酒泉。此次迁都，还带走了敦煌两万三千人户，敦煌实力大为削弱。再加上西凉将注意力转向东方，敦煌失去了经营西域的基地作用，因此当417年李暠去世之后，敦煌也随之衰败。嘉兴四年（420），北凉灭西凉，西凉王李歆弟李恂据敦煌继续抵抗。421年，沮渠蒙逊率部以水灌敦煌城，李恂派壮士出城掘堤，均被擒获。李恂最后兵败自杀，沮渠蒙逊屠城，敦煌丁壮遭灭顶之灾，敦煌城更加衰落。

　　　　北凉时期的敦煌衰微，没有特别的事迹。北魏太延五年（439），拓跋焘攻占姑臧，沮渠牧犍投降，北凉实际灭亡，仅凉王诸弟仍在河西西部抵抗，其中沮渠无讳据守敦煌。442年，无讳撤离敦煌，率万余家西渡流沙，占据鄯善，后入高昌，仍号“河西王”。北凉王族的这次撤退，带走了大批的敦煌户口，其中绝大部分是因北魏从东向西进攻而聚集敦煌的河西精英。在北凉灭西凉和北魏灭北凉的两次兵祸之中，敦煌遭到了前所未有的破坏。

　　　　442年，西凉王李暠之孙李宝乘沮渠无讳撤离之机，占据敦煌，并派李怀达入魏归降。北魏封李宝为沙州牧、敦煌公。444年，北魏召李宝入平城，直接控制敦煌，为经营西域和抗击北方的柔然，于此建敦煌镇。太平真君六年（445），北魏太武帝派成国公万度归发凉州以西兵，出敦煌，西击鄯善，后更破焉耆和龟兹。此战使西域大部分都为北魏所控制，丝绸之路再次打通，西域商人纷纷前来贸易。但好景不长，北方的柔然在此时控制了敦煌以西的西域地区，并直接控制了与敦煌最为接近的吐鲁番盆地。延兴二年至四年（472—474），柔然连犯敦煌，多者至三万骑。敦煌军民在镇将尉多侯、乐洛生的率领下，几败敌军，保住了敦煌。但在严峻的形势面前，北魏上层对是否要继续保有敦煌发生了分歧，不少人建议后撤凉州，放弃敦煌。给事中韩秀则认为，如果放弃敦煌，不仅凉州不保，关中也无宁日。孝文帝支持韩秀的意见，为加强敦煌的守备，升敦煌镇将为都大将。太和九年（485），穆亮任敦煌镇都大将，其为政宽简，并赈恤穷乏，敦煌经济得到恢复。492年，北魏出兵十万，击败柔然，敦煌从此得到安宁，但长年的征战和人口的流失，造成了这一地区“空虚尤甚”的局面，很难迅速恢复。

　　　　正光五年（524），北魏的北方边镇爆发六镇起义。八月，孝明帝下诏改镇为州，敦煌因盛产美瓜而名之为“瓜州”（一度易名为“义州”），辖敦煌、酒泉、玉门、常乐、会稽五郡，治所敦煌。六镇起义也影响到了河西，为加强河西统治，孝昌元年（525），明元帝四世孙元荣出任瓜州刺史。永安二年（529），元荣受封为东阳王。由于敦煌地处西北一隅，未受到北魏末年战乱的太大影响，即使在东、西魏分治的时期，元荣仍作为西魏的瓜州刺史，其统治直到大统十年（544）。元荣统治敦煌近二十年，他团结敦煌豪右，保境安民，并出资写经十余部，还在莫高窟开凿大型石窟。此时敦煌的经济文化得到了恢复和发展。元荣逝后，其子元康继任刺史之位，但元荣女婿邓彦杀康自立，西魏不得以而承认。大统十一年（545），西魏河西大使申徽至敦煌，在当地大族令狐整等人的协助下，捉拿邓彦，并将其送至京师治罪。546年，申徽任瓜州刺史，为政勤简，人民得以安居乐业。

　　　　557年，宇文觉立北周，与高洋北齐对垒。北周取代西魏之后，继续在敦煌设置瓜州，据《周书》记载，韦真、李贤曾为瓜州刺史。565—576年前后任瓜州刺史的建平公于义，继续了元荣在莫高窟开窟造像的活动，有碑云“建平、东阳弘其迹”。建德三年（574），北周武帝灭佛，但瓜州的佛教似乎只是开窟造像的短暂停歇，而并未受到多大的影响。

　　　　值得一提的是，自汉以来，河西地区特别是敦煌，已是文化极盛之地，文人学士大量涌现。从张轨出牧凉州起，就保境安民，兴办文教，选拔人才，为河西的地主阶级创造了保存和发展自己家族和家学的有利条件，从而吸引了不少的中州人士流向河西。河西的文人学士，多出西州大姓，如安定张氏、陇西李氏、略阳郭氏、西平田氏、金城宗氏以及敦煌宋、阴、索、氾等，都是儒学大姓。河西的敦煌儒士不仅在数量上占有优势，在学术成就上也遥遥领先。此外，他们还兴办学校，聚徒授业，传播和发扬传统文化。这些在当时中原动荡、京洛公学沦废，学术下移的背景下，为保存中国传统文化作出了重要贡献。